偷拍自拍 Big Panel Theory 系列之—32色东说念主PBMC拓展分型有策画（包含趋化因子受体、细胞因子和四聚体等）
免疫细胞表征是提高咱们对免疫学默契的相称垂危的本事之一偷拍自拍，其中，同期分析团结细胞的细胞表型和抗原特异性功能响应是很有价值的，一方面不错杀青更全面的免疫细胞算作解读，另一方面也可最大收尾地从有数的样本中取得尽可能多的信息。
流式细胞术是免疫细胞表征相称垂危的器具。早期的检测受有策画大小的局限，要么围聚检测免疫表型，要么仅专注于功能检测。连年来，跟着全光谱流式细胞术的发展，朝上30多个艳丽的有策画变得容易，更高等的概述分析成为可能。
来自荷兰莱顿大学医学中心传染病的臆度小组，基于Cytek® 全光谱流式系统，设立了32色东说念主PBMC拓展分型有策画，褪色细胞名义标志物、趋化因子受体、MHC-肽四聚体和细胞内细胞因子等检测艳丽。该有策画好像对细胞表型和评估免疫响应质料的艳丽进行概述分析，有助于对免疫系统默契的提高。
臆度圭表
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32色有策画包括23个主要细胞亚群的表型艳丽，以及9个评估HLA-E特异性T细胞相互作用和细胞因子产生的艳丽（表1）。有策画优化所波及的如抗体滴定、参比对照优化、自觉荧光窜改以及添加Brilliant Stain染料缓冲液和True-Stain单核细胞阻断剂等操作，均参考OMIP-069进行。
表1-32色有策画中包含的艳丽及兴趣兴趣
染色好的样本在Cytek® Aurora全光谱流式细胞仪上获取，获取数据用FlowJo v10.8.0和OMIQ分析软件（www.omiq.ai）进行分析。臆度者推选的染色经过如下图1所示（图1）。
图1 - 检测趋化因子受体、四聚体和细胞内细胞因子的
最好使命经过
臆度收尾
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1. 对于趋化因子、四聚体和胞内因子染色
趋化因子：测试4℃ vs 37℃下趋化因子受体的染色成果，发咫尺37°C下，对趋化因子受体CCR2、CCR4、CCR6、CCR7和CXCR3进行染色可改善信号，阐扬为阳性信号的颖悟度和分离度得到提高；而CX3CR1抒发水平受温度影响有限（图2A）。
四聚体：图2B上行所示为染色限定对四聚体（TM）染色性能的影响，当CCR和TM总共孵育（CCRs+TM），或TM染色后进行CCR染色（1TM， 2CCRs），与仅TM染色比拟（TM only），TM信号显着丢失；先对CCR进行染色，然后进行TM染色（1CCRS， 2TM），与最好的“仅TM”信号比拟，检测颖悟度雷同。图2B下行所示为染色限定对CCR4染色性能的影响，与仅CCR染色比拟（CCR only），在TM染色后CCR染色时（1TM， 2CCRs），不雅察到总CCR4群体的变化，而在TM染色之前进行CCR染色时（1CCRS， 2TM）未不雅察到。在TM染色之前进行CCR染色时，其他CCR也不雅察到与访佛的阐扬（图2C），趋化因子受体或四聚体的信号莫得丢失，因此，将其（1CCRS， 2TM）细目为最好染色限定。
图2 - 测试趋化因子受体、四聚体和细胞因子的染色条目和组合
胞内细胞因子：将细胞内IFN-γ和TNF-α染色与TM染色相勾搭（TM+ICS），并将这些标志物的性能与仅使用TM（TM only）或仅细胞内细胞因子检测染色（ICS only）进行比较（图2D）。四聚体阳性细胞的比例在TM only（0.41%）和TM+ICS时（0.40%）保握不变（图2D上行）。对于测试的两种细胞因子，与不使用TM染色比拟，在细胞内染色之前进行四聚体染色时，莫得不雅察到信号或细胞比例耗损。理解，高或低比例的细胞因子，在与低比例四聚体阳性细胞组合的情况下，均可被检测到，且不管是胞内细胞因子还是TM，其染色性能均不受共染色的影响。
2. 32色有策画的性能阐扬
手动设门和无监督聚类分析的数据分别披露于图3和图4。在扼杀不礼貌事件、双细胞和死细胞后，按设门逻辑次序差异出单核细胞（经典、非经典和中间）和淋巴细胞，后者字据抒发艳丽进一步进行类别和功能亚群细分，设门逻辑和详备分群情况可参考原文。（图3）
图3 - 32色有策画手动设门政策
通过UMAP降维和FlowSOM无监督聚类圭表，使用OMIQ软件可视化总共主要细胞亚群，主要分为CD4+ 细胞（细胞簇1-8） ，CD8+ 细胞（细胞簇9-15）， TCRγδ+ T细胞 （细胞簇16）， NK 细胞（细胞簇17），B细胞（细胞簇18-19），及单核细胞（细胞簇20-23）。图4C在聚类热图中展示了这些主要细胞亚群的艳丽抒发情况。（图4）
图4-通过UMAP和FlowSOM进行的高维数据分析
结 论
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嘟嘟嘟在线视频免费观看荷兰臆度者设立的32色东说念主PBMC拓展分型有策画，包括细胞名义艳丽，趋化因子受体，以及功能关连的四聚体和细胞因子艳丽。允许在团结个样本中，进行主要细胞亚群的识别，并同期武断抗原特异性和细胞因子。臆度者以为，对于免疫细胞库的臆度，这么的有策画曲直常实用的，将有助于扩大咱们对疾病景况、诊疗成果或疫苗指点响应的默契。
参考文件：
van Wolfswinkel， Marjolein偷拍自拍， et al. "Extensive flow cytometric immunophenotyping of human PBMC incorporating detection of chemokine receptors， cytokines and tetramers." Cytometry Part A (2023).